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    1、降低黄酒中EC(氨基甲酸乙酯)


    氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,简称EC),又名尿烷,分子式为C2H5OCONH2,分子量89.09。EC沸点为182~184℃,不易挥发,溶于水以及乙醇、乙醚、氯仿、苯等有机溶剂。EC广泛存在于发酵食品(如腐乳、酱油、奶酪、醋、面包等)、酿造酒(如中国黄酒、日本清酒、葡萄酒、苹果酒等)和蒸馏酒(如威士忌、白兰地等)中。


    2005年,世界卫生组织和联合国粮农组织下的食品添加剂联合专家委员会探讨了EC安全性问题,并结论性提示EC的大量存在会威胁到人类的身体健康。


    在已报道的风险因素中,EC是影响范围最广,毒性最强的一种潜在致癌物。2007年,国际癌症研究机构专家会议上,正式决定将EC的致癌风险由2B类修改为2A类,其危险性等同丙烯酰胺。


    欧盟和FAO已将EC列为重点监控对象。欧美多国都已制定了酒精饮品中EC的限量标准。我国目前尚未拟定EC的限量标准。日本把我国的黄酒与日本的清酒归入加强酒行列,清酒中EC的限量为100μg/L。目前,欧美各国根据日本清酒中的EC限量标准来要求我国出口黄酒中EC含量≤100μg/L。


    我国黄酒中EC含量普遍较高。2012年6月中国香港消费者委员会公布了市售酒精饮品中EC含量的调查结果,其中,16款黄酒产品中均含有EC,含量最高达260μg/L。黄酒中EC含量偏高的问题不仅带来了严峻的食品安全问题,同时也使黄酒的出口受到严重限制。


    探索适合我国黄酒企业控制EC含量的措施,降低黄酒中EC的含量,对于我国黄酒产业的发展壮大具有重大意义。


    在黄酒生产过程中,酿造原料会带入一部分EC前体物,而发酵醪液中的酿酒酵母、乳酸菌等微生物代谢所产生的尿素和瓜氨酸是黄酒中EC前体物质的主要来源。黄酒中积累的瓜氨酸,在煎酒和灭菌加热工段能够与乙醇反应形成数量可观的EC,是黄酒中形成EC的另一重要前体物质。


    目前,控制EC前体物包括原辅料清洗降低尿素的带入、选育低产尿素酵母降低尿素的产生、应用脲酶分解酒液中的尿素等;EC生成过程的控制主要是生产工艺的调节与控制;直接去除EC包括了材料吸附去除和EC降解酶分解。目前控制EC的途径,主要集中于以下四个领域,如下图所示。




    采用的关键技术与方法有:


    (1)代谢工程改造


    利用低产尿素的黄酒酵母菌株进行黄酒发酵可以有效降低酒液中尿素的含量,进而降低黄酒中EC的含量。因此,利用诱变育种、代谢工程改造育种手段,以酿酒酵母为改造对象,通过靶向基因的敲除和高表达,构建低产或不产EC前体物的优良菌株选育低产氨基甲酸乙酯前体物的酿酒酵母。

    食品安全级低产EC酵母工程菌的构建,可以从根源上解决黄酒中EC含量偏高的问题,有利于提高我国黄酒的饮用安全性,促进黄酒业的国际化发展。通过菌种选育筛选低产EC前体物的酵母工程,可以从根本上减少黄酒发酵过程中EC的形成。代谢工程改造可以对酿酒酵母的靶向基因进行突变、敲除、过量表达等定向修饰,从而获得预期的表型特征,该技术已经在葡萄酒酵母、啤酒酵母和清酒酵母改造中得到广泛应用,而且部分研究成果也已应用于工业化生产。因此,利用“自克隆”技术,以酿酒酵母自身基因组为遗传操作模板,通过代谢工程改造构建低产或不产 EC 前体物的黄酒酵母工程菌应用于工业化生产,可以在不改变现有生产工艺的基础上减少发酵液中EC的形成。


    (2)生物酶解


    利用生物酶特异性地降解EC前体物或者已经形成的EC。目前,研究较多的两种酶为尿素降解酶和EC降解酶。

    脲酶去除尿素,有操作简单、能耗小、时间短、不改变生产工艺、不影响原酒风味等优点。欧盟、国际葡萄酒组织等通过了脲酶(主要是酸性脲酶)以添加剂在酒体中使用的许可。日本的武田化学、长濑化成和美国的Enzeco Acid Urease都推出了成熟的商用脲酶。国内尚无自主产权的商业化酸性脲酶。

    复合固定化脲酶能够明显降低黄酒中尿素的含量,从而能直接减少煎酒过程中EC的生成。开发出一种黄酒用固定化中性脲酶具有重大意义。

    目前还没有能适应黄酒环境的耐酸耐醇的EC降解酶开发出来。

    中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏了一株高产脲酶的聚多曲霉菌株(保藏号:CGMCC No.6577,保藏地址:中科院微生物所)。该聚多曲霉产脲酶活性可以达到49.7U(远高于江南大学分离获得的肠出血性大肠埃希氏菌,产脲酶活性为0.58U;浙江大学分离的高产酸性脲酶菌株肺炎克雷伯氏菌,产脲酶活性为17.17U。),为脲酶的生产和开发提供了宝贵的菌株资源。该菌株系从酒曲中分类出来,生产的高纯度脲酶已应用于白酒中,有效降低了曲药中尿素含量。以此为基础,可以开发针对黄酒的固定化脲酶,为黄酒酒用脲酶制剂提供了新的选择。


    (3)工艺优化


    温度和时间是影响EC反应速率的重要因素。黄酒独特的生产工艺如高温煎酒、灭菌、长时间贮存、年份酒勾兑等都对EC的形成有直接影响。因此,可以通过优化和调整生产过程中的高温工段,降低黄酒中EC的含量。

    目前,我国黄酒生产过程中,煎酒工序一般在80~95℃进行,而且各个厂家都凭生产经验控制煎酒时间,没有统一的标准。而日本清酒的灭菌工序仅在60℃保温2~3min,灭菌温度比黄酒低得多。因此,可以适当降低黄酒的煎酒温度和缩短煎酒时间以减少EC的形成。尽管EC含量随着煎酒温度的降低会有所减少,但是黄酒中尿素的含量没有减少,在长时间贮存过程中仍然会形成大量的EC。另外,此方法涉及到黄酒风味和生物稳定性的变化,存在不确定性,因此没有进行工业化应用。

    通过适当的预处理方法可以减少由原料带入的EC前体物;利用树脂、活性炭、硅藻土等具有吸附功能的材料,可以直接吸附去除黄酒品中已经存在的EC。通过优化和调整生产过程中的高温范围和时间,以杀死其中所有的微生物,并使得蛋白变性、沉淀,从而改善酒质,提高成品黄酒的稳定性,降低黄酒中EC的含量,并便于长时间贮存。

    原料预处理可以减少原辅料中尿素带入。如大米经过精制和多次清洗等可降低尿素含量。有研究表明当精米率达到60%时,米中尿素含量可降低57%左右;大米用清水清洗两遍,可去除米中一半左右的尿素,米中瓜氨酸含量可降低近60%,精氨酸含量降低约13%。但是米过度的精制和清洗会造成营养成分的大量损失,并影响后续工艺及产品最终品质。

    具有吸附功能的材料吸附去除EC虽然可以实现大规模生产,而且操作步骤简单,但当前面临的关键问题是材料对EC选择性与专一性较差,对酒体产生一定的影响。


    2、消除黄酒微生物污染


    黄酒需要经过一定时间的贮存来提高品质。如何防止黄酒微生物污染一直是黄酒行业一大难题。坛装黄酒在贮存过程中会因坛漏、包装损坏及灭菌不彻底等因素而引起浑浊酸败。袋装黄酒因价格低廉,受到部分消费者的欢迎,有较大的市场份额。袋装黄酒比瓶装黄酒更易出现胀气、酸败等微生物污染现象,其原因是袋装黄酒杀菌后冷却到一定温度灌装,灌装时易受微生物污染,而且袋装黄酒的酒精度较低使微生物更易繁殖。


    采取的主要方法:


    (1)一方面开发出快速适用的检测方法,避免遭受微生物污染的黄酒流入市场,造成质量事故。


    (2)另外,针对黄酒酸败、浑浊、产生醭膜或白花等微生物污染机理,通过对黄酒污染微生物的系统深入研究,制订针对性的控制措施。


    (3)低温冷冻过滤技术、分离过滤综合技术等的引进和应用,去除黄酒病菌及微生物和沉淀物,延长瓶装黄酒稳定性。


    目前,黄酒煎酒杀菌阶段使用的方法有三种工艺:热酒杀菌灌装工艺、水浴杀菌灌装工艺和喷淋杀菌灌装工艺,但这三种工艺都存在问题:一是热酒升温易产生酒精度的损耗,二是热酒升温易产生风味的散化和香气物质的损失,三是升温需要的能源消耗偏大。

    膜是一种优秀的分离工具,其中超滤可以滤除微生物和病菌,而且由于在膜过滤过程中无需升温,使用超滤膜过滤黄酒除菌还可以避免酒精度和风味物质的损耗。无论是对传统型黄酒还是清爽型黄酒,采用膜法可在不升温情况下实现对致病菌的完全去除,而且经膜过滤后,所得澄清酒液中的总糖、总酸和酒精度,以及乙酸乙酯、己酸乙酯、β-苯乙醇、正丙醇和异戊醇等香气物质的活力值,与原酒液相比含量变化极小。


    此外,针对目前国产酱油、黄酒等产品在货架期出现二次沉淀和微生物指标不达标两大软肋,利用现代膜分离、超滤、纳滤、精滤技术,实现了传统酱油、黄酒等产品脱盐、澄清、超滤浓缩与冷杀菌一体化,显著提高了产品质量、降低了能耗、提高了产品的微生物安全性,同时响应了食品低钠化的健康饮食潮流。


    中科院工业膜开发与创新应用团队已经成功开发的上述工艺技术及设备装置,并应用于工业化生产,关键技术和方法,如下:


    1)利用嵌段共聚物的自组装方法和传统浸没沉淀相转化制膜法相结合,直接制备孔径均一的不对称分离膜。该不对称分离膜是高通量、高选择性的高分子分离膜,克服现有高分子膜的孔隙率低,选择性能低,分离效率差、分离效果不佳等技术瓶颈。不仅可以方便地实现分离层和支撑层的一体化,从而提高膜的稳定性和机械性能,而且通过调节嵌段共聚物的分子量、化学组成、化学结构还可以精确控制分离膜的孔径和性能,从而赋予分离膜特殊的功能和性能。


    2)提高膜分离过程效率的技术方法。该方法在常规错流膜分离设备及操作工艺的基础上,通过设计适宜的管路和阀门,采用周期换向-脉冲冲刷方法减轻膜污染,即在膜过滤过程中,在一定的时间间隔下,周期性交替改变膜组件原料液进出口从而交替改变料液在膜面的流动方向。同时,周期性关闭透过液侧阀门并增大料液循环速度使料液以高流速冲刷膜表面,可取得类似反洗的效果。采用本方法可有效减轻膜表面的污染程度,提高渗透通量,使膜分离设备的过滤效率得到明显提高。该方法简单易行,适于在工业化生产中推广应用。


    3)降低微生物发酵-膜分离耦合过程中膜污染的方法。该方法的技术特点是,在微生物发酵-膜分离耦合过程中,每隔一段时间用补料溶液对膜分离单元进行反洗。采用补料溶液反洗,既降低了膜污染,提高了膜通量,又对发酵罐中的培养基进行了补充,同时没有引入外来清洗介质。该方法操作简单,实用性强,不影响发酵-膜分离耦合过程的连续运行,易于工业化推广。